Los Angelesben született Diane Hall néven, apja mérnök, anyja félhivatásos fényképész - a korábbi Mrs. Los Angeles - volt. Ötévesen már a templomi kórus tagja lett, később szólistaként énekelt. Konzervatív nevelést kapott, de erős egyénisége és különc stílusa nem tűrte a korlátokat. Mindent kitalált, hogy magára vonja a figyelmet, fekete neccharisnyával és fehér ajakrúzzsal botránkoztatta meg szüleit.

Kaliforniában tanulta ki a színjátszás elméletét, majd egy kis New York-i színházban a gyakorlatát, ekkor vette fel anyja családnevét, mert a színész céhnek már volt egy Diane Hall nevű tagja. (Pályatársai közül Buster Keaton, minden idők egyik legnagyobb komikusa és Michael Keaton csak névrokona. Ez utóbbi - aki Michael Douglasként született - saját bevallása szerint azért választotta a Keaton művésznevet, mert tetszett neki Diane.)

A színésznő 1968-ban beugróként került a Hair című musicalbe a Broadwayn. Nemsokára eljátszhatta Woody Allen Játszd újra, Sam! című vígjátékának egyik főszerepét, alakításáért a színházi Oscarnak nevezett Tony-díjra jelölték. Keaton arcát reklámokból ismerte meg a széles közönség, felvevőgép elé 1970-ben állt először, a kiugrást 1972-ben Francis Ford Coppola A Keresztapa című filmje jelentette számára.

Ugyanabban az évben a Woody Allen rendezte Játszd újra, Sam! filmváltozatában szerepelt, kettejük között a színfalak mögött románc szövődött. 1977-ben forgatta Allennel az Annie Hallt: a pár nyíltan önéletrajzi ihletésű filmje keserédes, lélekmelengető vígjáték, a cím is rá utal: a Hall az eredeti neve, az Annie pedig a beceneve. Sokak szerint ebben nyújtotta élete legnagyobb alakítását, amelyet Oscar-díjjal jutalmaztak, ráadásul a filmben viselt ruháival és frizurájával divathullámot indított el.

A siker nyomán a legnagyobbak közé emelkedett. A következő két évben csak két filmet vállalt el Woody Allen rendezésében: a Belső terek bergmani lélektani dráma, a Manhattan pedig az Annie Hall-téma variációja. A pár útjai ezután a szakmában és a magánéletben is szétváltak, Allen helyébe mindkét téren Warren Beatty lépett, akinek Vörösök című filmjében egy újságírónőt alakított, amiért 1981-ben ismét Oscarra jelölték.

1986-ban átállt a kamera másik oldalára, és megrendezte a Mennyország című dokumentumfilmet. A következő évben - több mint egy évtized után - ismét Woody Allennel dolgozott A rádió aranykorában, majd a Baby Boom című filmben alakított egy menedzsernőt, akinek életét az változtatja meg, hogy "örököl" egy gyermeket.

Szerepelt A Keresztapa harmadik részében, az Örömapa 1-2. részében és az Elvált feleségek klubja című vígjátékokban. A fajsúlyosabb Marvin szobájáért 1996-ban újra Oscar-díjra jelölték.

Õ rendezte a Twin Peaks című nagysikerű tévésorozat egyik epizódját és több zenei videót is. 1995-ben elkészítette első egész estés játékfilmjét, az Álmok hősei című filmdrámát, 2000-ben pedig a parádés szereposztású Női vonalak munkálatait irányította. Játszott Allen Rejtélyes manhattani haláleset című alkotásában, hangját adta a Nicsak, ki beszél most! című filmhez, közel a hatvanhoz pedig még mindig szexis és elbűvölő asszonyként csavarta el Jack Nicholson fejét a Minden végzet nehéz című filmben, alakításáért negyedszer nominálták Oscarra.

Az utóbbi évtizedben romantikus vígjátékot (Kőkemény család; Férjhez mész, mert azt mondtam; Ébredj velünk; A nagy nap; Szerelem a végzetem) és filmdrámát (Egy drága társ; Ruth és Alex) egyaránt forgatott. Legutóbbi filmjét, a Káosz karácsonyra című komédiát december óta vetítik a magyar mozik. Következő televíziós munkájában egy apácát fog alakítani az HBO sorozatában.

Pályája során számos alkalommal formált meg érzékeny, okos és humoros, ugyanakkor excentrikus, szabad szellemű, független gondolkodású nőket. A kritikusok elsősorban átváltozóképességét emelik ki. A legrangosabb kitüntetésekkel büszkélkedhet: Oscar-díja mellett két Golden Globe-díj tulajdonosa, a többi közt megkapta a brit filmakadémia díját, s eddigi filmes tevékenységét több életműdíjjal ismerték el.

Bár több filmbéli kollégája a magánéletben is társa volt, soha nem ment férjhez. Ötvenévesen két gyermeket fogadott örökbe, és a vásznon is gyakran osztanak rá anyaszerepet. A színészet és a rendezés mellett érdekli a fotózás és díszlettervezés.

Öltözködésének fiatal kora óta nagy figyelmet szentel, ruházatának elmaradhatatlan kelléke - évszaktól függetlenül - a kesztyű és a kalap, leginkább a fehér színt kedveli. A Marlene Dietrich által elkezdett, majd Katharine Hepburn által folytatott hagyományt felélesztve rendszeresen hord nadrágkosztümöt. Önéletrajzi könyve 2012-ben magyarul is megjelent, ebben saját pályája mellett édesanyja portréját is megrajzolta.

A színésznőt Woody Allen egyszer így jellemezte: "A való életben Keaton hisz Istenben. De abban is hisz, hogy a rádió azért működik, mert kis emberkék vannak benne."